CFSE 稀释增殖检测是评估 T 细胞克隆扩增能力的经典方法：染料随每次细胞分裂均等减半，在流式图上形成阶梯状分裂峰，可定量还原每代入孔细胞的增殖历史。本方案以小鼠脾脏 T 细胞为例，整合 EasyIso™ 无柱阴选分选与 ActBeads™ 激活体系，覆盖从样本制备到分裂峰读出的一站式操作流程。
实验原理：为什么 CFSE 能“数出”细胞分裂了几次
CFSE（CFDA-SE）本身无荧光、可自由穿越细胞膜；进入细胞后被胞内酯酶水解脱去乙酰基，转变为带荧光的 CFSE，并与胞内蛋白上的自由胺基（赖氨酸残基等）发生不可逆共价结合。因此标记完成后荧光被“锁”在细胞内，不会被培养基洗脱或细胞间交换。
关键在于均分机制：细胞每分裂一次，胞内荧光染料被两个子代细胞均等分配，每个子代细胞的荧光强度即减半。在流式分析时，FITC 通道（488 nm 激发）上可观察到间隔一致的二倍递减峰——0 代（未分裂）、1 代、2 代……由此可定量计算分裂指数（增殖细胞的平均分裂次数）与前体频率（发生增殖的起始细胞比例），比单纯计数更能反映 T 细胞的克隆扩增能力。
- CFSE 检测的是“增殖历史”，与 ³H-TdR 掺入或 EDU 标记的“DNA 合成瞬时快照”互补
- 若实验需同时使用 FITC 通道抗体，可改用紫激光的 eFluoro™ 450 等替代染料
- 标记浓度过高（>5 μM）可能影响细胞活力与功能，建议按本方案 5 μM 起始优化
实验流程总览
整体流程：脾脏制备 → CFSE 标记 → 分选 → 激活培养 → 流式检测（48–72 h）。
- A 样本制备：脾脏研磨、过滤、洗涤（70 μm 滤网，400 × g × 5 min）
- B 荧光标记：CFSE 2× 加入法（终浓度 5 μM，37 °C 避光 10 min）
- C 分选与激活：无柱阴选 + 磁珠/IL-2 激活（1 × 10⁵/孔，24–72 h）
- D 流式检测：抗体/死活染料复染、读分裂峰（FITC 通道，48–72 h）
Phase A：脾脏单细胞悬液制备
- 1. 处死小鼠（颈椎脱臼或 CO₂），75% 酒精消毒后取出脾脏，PBS 洗 2 遍，置于 70 μm 无菌细胞滤网上
- 2. 滤网放入 50 mL 离心管，加 2 mL PBS，用注射器活塞轻轻研磨脾脏，用 EasyIso™ 缓冲液反复冲洗细胞至离心管
- 3. 400 × g 离心 5 min，弃上清
- 4.（可选）红细胞裂解：2 mL 1× ACK 缓冲液，室温 1 min
- 5.（可选）加 5 倍体积 PBS 中和，400 × g 离心 5 min，弃上清
- Note：采用英诺思 EasyIso™ 系列阴选分离试剂盒，可省略裂红步骤
- 6. 细胞计数
Phase B：CFSE 标记
- 7. PBS 重悬细胞，调整浓度至 2 × 10⁷/mL
- 8. 用 1× PBS 将 CFSE 稀释至 10 μM（2× 浓度）——提前稀释染料可使标记更均匀
- 9. 将等体积 10 μM CFSE 加入细胞悬液（终浓度 5 μM），迅速混匀，37 °C 培养箱避光孵育 10 min
- 10. 加入 5 倍体积完全培养基（含 10% FBS），轻柔涡旋混匀，4 °C 孵育 5 min 终止反应，400 × g 离心 5 min，弃上清
- 11. 用 EasyIso™ 细胞分选缓冲液洗涤 2 次（重复步骤 10 的离心条件）
Phase C–D：分选、激活与检测读出
分选推荐 EasyIso™ 无柱阴选：目标 T 细胞不接触磁珠，增殖功能与表面状态完整保留。激活体系以 ActBeads™ CD3/CD28 磁珠 + IL-2 重建生理性 priming 信号。
- 12. 按分选试剂盒说明书对细胞进行分选（推荐 EasyIso™ 无柱阴选）
- 13. T 细胞培养基重悬，调整浓度 1 × 10⁶/mL，每孔 100 μL（1 × 10⁵/孔）
- 14. 每孔补充 100 μL T 细胞激活培养基（终浓度 100 U/mL human IL-2 + 25 μL/mL ActBeads™ T 细胞激活磁珠）
- 15. 激活后 24 h：镜下观察细胞变大/变长（激活成功的形态学标志）；可用 CD25、CD69、CD71 等标志物流式验证活化状态
- 16. 激活后 48–72 h：轻轻吹匀，取 50 μL 细胞，用流式抗体与死活染料复染后上机，分析 CFSE 分裂峰的偏移与占比
结果分析要点
- 通道选择：CFSE 主检通道为 FITC（488 nm 激发 / 525±20 nm 发射）；复染抗体避开 FITC 通道
- 设门策略：先以 FSC/SSC 圈定活细胞 → 死活染料排除死细胞 → 再看 CFSE 荧光分布；初始代（0 代）峰应锐利、CV 小
- 定量指标：分裂指数 Division Index = Σ(n·分裂代数)/Σ(发生分裂的细胞数)；前体频率 Precursor Frequency = 发生 ≥1 次分裂的起始细胞占比
- 对照设置：未标记管（自发荧光）、仅标记未激活管（0 代基准）、单染管（补偿调节）
注意事项
- 全程避光操作（标记后尤其重要），防淬灭
- 标记后的洗涤务必充分：游离 CFSE 残留会导致非特异性背景与“假分裂峰”拖尾
- 终浓度、细胞密度与混匀速度是标记重复性的三大变量——CFSE 加入后应迅速混匀，避免局部浓度过高
- 若分选后再标记，注意阴选磁珠残留不影响标记；若先标记后分选（本方案顺序），分选过程避光即可
实验要点
- 脾脏研磨用 EasyIso™ 缓冲液冲洗，配合 EasyIso™ 阴选试剂盒可免裂红，减少操作步骤与细胞损失（注：部分厂家以 PBS 配置的分选 buffer 会影响细胞存活，选用前可联系厂家技术确认）
- CFSE 采用 2× 加入法（10 μM 染料 + 等体积细胞悬液 → 终浓度 5 μM），标记更均匀
- 完全培养基（10% FBS）+ 4 °C 终止反应，是保证标记不过度的关键
- 无柱阴选让目标 T 细胞不接触磁珠，增殖功能不受影响
- ActBeads™ CD3/CD28 磁珠 + IL-2 模拟生理性 priming 三信号（TCR + 共刺激 + 细胞因子）
- 24 h 看激活（形态 + CD25/CD69/CD71），48–72 h 看增殖（分裂峰）
推荐产品（按种属分类）
细胞分选（阴选）
SN3101人CD3 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）总T细胞SN3102人CD4 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）CD4⁺辅助TSN3103人CD8 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）CD8⁺细胞毒TSN3104人naive CD4 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）极化实验推荐SN3107人naive CD8 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）细胞分选（阳选）
PH003anti-human CD3 Nanobeads（有柱阳选）PH004anti-human CD4 Nanobeads（有柱阳选）产品页即将上线PH008anti-human CD8 Nanobeads（有柱阳选）产品页即将上线细胞分选Buffer
EISO0500EasyIsoBuffer™ 细胞分选缓冲液人/小鼠通用常见问题
CFSE 标记后分裂峰拖尾、分不开是什么原因？
常见原因有三——标记时未迅速混匀导致局部染料浓度过高；标记后洗涤不充分，游离 CFSE 残留；细胞状态差（活力低）。建议严格按 2× 加入法操作，并保证 2 次以上充分洗涤。
为什么用阴选试剂盒可以不裂红？
EasyIso™ 阴选通过去除非目标细胞富集 T 细胞，红细胞在分选过程中随阴性流出组分被弃去，因此可省略单独的 ACK 裂红步骤，减少一步细胞损失。
检测时间点怎么选？24 h 还是 72 h？
24 h 适合评估激活（CD25/CD69/CD71 上调与形态变化），此时增殖尚未启动；48–72 h 分裂峰逐渐展开，是读增殖的最佳窗口。若分裂峰已“跑丢”（多为高代次），可提前至 48 h 检测。