T细胞分选（阴选）与培养

阴性选择（阴选）使用针对非目标细胞的抗体鸡尾酒标记「不要的细胞」（B 细胞、单核/巨噬细胞、DC、NK、粒细胞、红细胞前体等），再以磁性微珠捕获这些标记细胞并移除；目的 T 细胞从未接触磁珠与抗体——表面表位完整保留、无抗体交联引发的预激活风险。阴选的分选速度较快，操作简便一些。

与之相对，阳性选择（阳选）直接标记目标 T 细胞本身，纯度与得率通常更高、速度更快，适合复杂的小鼠组织样本。阳选的细胞同样可以进行培养，两类策略并无优劣，只有适用边界：

无柱体系的分离方式：EasyIso™ 无柱阴选用磁极（磁场）吸附磁珠标记的细胞，目的细胞留在上清中直接倾出回收——无需过柱、剪切力小、全程约 20 分钟，与有柱体系（配合标准分选柱）互为补充。

• 后续要做功能实验（极化 / 杀伤 / 增殖 / 回输）→ 阴选
• 面对复杂的组织样本，如肝脏、胰腺等 → 阳选亦可（PM004/PM008）
• 样本稀有或得率优先 → 阳选（得率通常在 85% 以上）
• 需要保持静息状态（如 naive T 极化前体）→ 必须阴选

整体流程：样本制备 → 阴选分选（标记 → 磁极吸附 → 上清回收）→ 质检 → 激活培养 → 扩增/下游应用。

• A 样本制备：人源 PBMC（Ficoll 或商品化分离管）/ 小鼠脾脏研磨
• B 阴选分选：抗体鸡尾酒标记非目标细胞 → 磁珠结合 → 磁极吸附 → 上清即目的 T 细胞
• C 纯度质检：流式 CD3（人）/ CD3ε 或 CD4+CD8（小鼠）复核，预期纯度 85-95%
• D 激活培养：CD3/CD28 激活磁珠 + IL-2，37 °C、5% CO₂
• E 扩增与下游：半换液补因子 → 去磁珠 → 增殖检测 / CAR 转导 / 功能实验

**人源（PBMC）**：① 抗凝外周血（肝素/EDTA）用 PBS 1:1 稀释；② Ficoll 密度梯度离心（400 × g，30 min，室温，无刹车），吸取白膜层淋巴细胞；③ PBS 洗涤 2 次（300 × g × 10 min）；④ EasyIso™ 缓冲液重悬，计数，调浓度至 1 × 10⁸/mL。

**小鼠（脾脏）**：① 处死小鼠，75% 酒精消毒，取脾脏置 70 μm 滤网；② 加 2 mL PBS，注射器活塞轻柔研磨，缓冲液冲洗至 50 mL 离心管——这一步的 PBS 至关重要，目前测试部分厂家的 PBS 会导致 T 细胞活性差、无法增殖，详情联系英诺思生物客服；③ 400 × g × 5 min 离心，弃上清；④（可选）2 mL 1× ACK 裂红，室温 1 min，5 倍体积 PBS 中和；⑤ 缓冲液重悬，计数，调浓度至 1 × 10⁸/mL。

**Note**：EasyIso™ 小鼠阴选试剂盒可在分选中同步去除红细胞，脾脏样本可省略裂红步骤，减少一步细胞损失。

以 EasyIso™ 无柱阴选试剂盒为例（人源 SN3101-SN3107 / 小鼠 SN4101-SN4107），全过程在 2-8 °C 或室温进行（按说明书），使用预冷的 EasyIso™ 分选缓冲液。

• 1. 取 1 × 10⁸ 细胞（不足则按比例缩小组分用量）
• 2. 按说明书体积加入阴选抗体鸡尾酒（Fractionation antibody cocktail），轻柔吹匀，孵育 10 min
• 3. 按说明书体积加入磁性微珠，轻柔吹匀，孵育 5 min
• 4. 加入缓冲液补至推荐体积，轻柔混匀
• 5. 将分选管置磁极（磁架）上，静置 2-5 min 至液体澄清
• 6. **保持管子在磁极上**，倾出（或吸出）上清至新管——上清即目的 T 细胞（未接触磁珠）
• 7. 重复磁极吸附 1 次（提高纯度，可选）：上清再上磁极 2-3 min，转移上清
• 8. 300 × g × 5 min 离心浓缩，培养基重悬，计数
• 孵育期间每 2-3 min 轻柔混匀 1 次，避免细胞沉降影响标记效率
• 磁极吸附时不要晃动管子，等待液体完全澄清再倾倒
• 倾倒动作一气呵成，管口不留残滴回流
• 全程使用预冷缓冲液可降低非特异性标记（按试剂盒说明书温度执行）

• 1. 取 1-2 × 10⁵ 分选后细胞，流式抗体复染（人：CD3；小鼠：CD3ε/CD4/CD8）
• 2. 同时保留分选前样本作对照，计算纯度提升
• 3. 台盼蓝或死活染料评估活力（预期 > 90%）
• 4. 记录得率（回收细胞数 / 起始目标细胞数）
• 预期纯度：总 T（CD3）阴选通常大于 95%；亚群分选（CD4/CD8/naive）以说明书标注为准
• 若纯度不足：检查标记孵育时间、磁极吸附时长、缓冲液体积
• 若得率偏低：降低离心力对细胞的损伤（室温 300 × g），检查倾倒时上清是否残留

生理性激活需要三重信号——TCR 识别（信号 1）+ CD28 共刺激（信号 2）+ 细胞因子（信号 3）。ActBeads™ CD3/CD28 激活磁珠将 anti-CD3 与 anti-CD28 固化于珠面，一粒磁珠即同时传递信号 1 与信号 2；IL-2 提供信号 3。人源用 AH2001，小鼠用 AM2001。

操作步骤：1. T 细胞培养基重悬分选后细胞，调整细胞浓度 0.5 × 10⁶/mL；2. 铺板：96 孔板每孔 200 μL（1 × 10⁵）；48 孔板每孔 600 μL（3 × 10⁵）；24 孔板每孔 1200 μL（6 × 10⁵）；3. 加入 ActBeads™ 激活磁珠至 2.5 μL / 1 × 10⁵ 细胞，终浓度（人 AH2001 / 小鼠 AM2001）；4. 加入 IL-2：人源 CTK301 100 U/mL（小鼠培养中人源 IL-2 同样有效，建议采用人的 IL-2）；5. 37 °C、5% CO₂ 培养箱培养；6. 24 h：镜下观察——细胞变大、变长、聚集成簇（激活成功的形态学标志），流式可查 CD25/CD69 上调；7. 48-72 h：半换液（吸取一半上清补新鲜培养基 + IL-2），维持浓度 0.5-1 × 10⁶/mL；8. 扩增期（72 h 后）：每 2-3 天半换液补因子，细胞密度超过 2 × 10⁶/mL 时 1:2 传代。

以下数据来自英诺思生物内部验证：人 CD3⁺ T 细胞经 EasyIso™ 无柱阴选分选后，按本 protocol 以 AH2001（25 μL / 1 × 10⁵ 细胞）+ 100 U/mL human IL-2（CTK301）激活培养 48 h，BD 流式仪读出。配套产品 AH2001 + CTK301 + C300100。

• 激活磁珠用量可梯度优化（12.5 / 25 / 50 μL/mL），刺激强度与磁珠剂量正相关
• 若下游是 CAR 转导：激活 24-48 h（细胞进入分裂期）是逆转录病毒转导的黄金窗口
• 若下游是增殖检测（CFSE/CTV）：请移步《小鼠T细胞CFSE实验》专页查看标记与检测细节
• A 板（FSC vs SSC）：No-activator 对照组淋巴细胞门内 98.2 %，细胞集中在低 FSC/SSC 区（直径 4-6 μm，未活化的小淋巴细胞形态）；B 板 CD3/CD28 Beads 组门内 70.2 %，FSC 与 SSC 双向上升至 9-12 μm，活化后胞体与内含物（线粒体/核糖体）显著增大。磁珠集中在 FSC 轴最左侧（小尺寸区）分布均一、不混入主细胞群，不干扰淋巴细胞门内的激活判读
• C 板（CD25 vs CD69）：unstimulated 对照组 CD25⁻/CD69⁻ 双阴 95.7 %；D 板 Stimulated by ActBeads™ 组 CD25⁺/CD69⁺ 双阳 84.1 %，CD25 高表达 + CD69 高表达同时出现，证明本体系 48 h 即可高比例驱动 T 细胞进入活化状态
• 形态学（FSC/SSC 上升，A→B）+ 表型（CD25⁺CD69⁺ 双阳率上升，C→D）两个维度共同验证 AH2001 + CTK301 体系的激活效力
• 48 h 是细胞因子支持的 T 细胞活化的稳定读出点；24 h 时 CD69 早表达通常更强，但 CD25 持续高表达一般需 48-72 h
• FSC / SSC 上调是低成本、快速的「激活成功」早期判读指标，无需染色即可在流式 FSC/SSC 散点图直接评估
• 配伍产品：AH2001（人 T 细胞激活磁珠）+ CTK301（Human IL-2）+ C300100（人 T 淋巴细胞培养基）

延伸阅读：《T细胞激活磁珠需要洗涤吗？英诺思 ActBeads™（AH2001/AM2001）免洗涤工艺与进口对照横向实测》——ActBeads™ 与进口对照在同源平行体系中的 CD25/CD69 双阳率与 CFSE 增殖对比数据、免洗涤工艺说明与磁珠均一性验证方法。

通常情况下，T 细胞激活磁珠不需要去除，它不会造成 T 细胞耗竭，也不会影响 T 细胞生长。磁珠上的抗体会随着时间失活，并且磁珠的比例会随着 T 细胞大量扩增，占比会变得非常小。不过，在 T 细胞回输动物实验中，磁珠是需要去除的。

磁极去除步骤：1. 收集培养细胞至分选管，置磁极 2-5 min；2. 磁珠贴壁后，转移含细胞上清至新管（无需离心）；3. 300 × g × 5 min 洗涤 1 次后进入下游应用。

• 增殖检测：CFSE/CTV 稀释法 → 《小鼠T细胞CFSE实验》
• 极化诱导：Treg / Th1 / Th2 专页（DM101 等）
• CAR-T：CAR 设计与杀伤验证专页
• 冻存：无血清冻存液 CR101，程序降温后液氮保存（复苏活力通常 ≥ 85%）

分选当天完成激活铺板效果最佳；若需过夜，4 °C 静息保存，次日计数后使用。操作细节如有疑问，可联系英诺思技术团队（189 1304 2753）获取针对性建议。

• 分选当天完成激活铺板效果最佳；若需过夜，4 °C 静息保存，次日计数后使用
• 部分厂家以 PBS 配置的分选 buffer 会影响细胞存活，选用前可联系厂家技术确认（EasyIso™ 缓冲液配方针对细胞活性优化）
• 激活培养密度不要低于 0.5 × 10⁶/mL，低密度培养 T 细胞存活率显著下降
• 半换液而非全换液：保留自分泌因子环境，减少培养波动
• 每次操作记录：起始细胞数、分选后得率、纯度、活力——QC 追溯是重复性的基础