CAR-T 杀伤功能验证的经典体外模型：效应细胞与靶抗原阳性肿瘤细胞按效靶比梯度共培养，以萤光素酶、LDH 释放或流式凋亡染色定量杀伤，并以抗原阴性对照体系验证特异性。本页给出实验设计与全套靶细胞方案。
CAR-T 杀伤的机制
CAR 与靶抗原结合后，免疫突触快速形成，CAR-T 通过两条通路杀伤靶细胞：穿孔素/颗粒酶通路（Ca²⁺ 依赖，颗粒酶 B 诱导靶细胞凋亡）与 Fas/FasL 通路（死亡受体级联）。与天然 CTL 相同，一个 CAR-T 可连续杀伤多个靶细胞（serial killing）；同时旁分泌 IFN-γ、TNF-α 等细胞因子，招募并激活其他免疫细胞。
CAR 识别不依赖 MHC 呈递，直接结合表面完整抗原，因此不受肿瘤 MHC 下调逃逸的影响——这也是 CAR-T 相对 TCR 疗法的核心优势，但同时也要求靶抗原在正常组织表达的安全性评估。
体外杀伤实验设计
三个设计变量：① 靶细胞——Raji（CD19⁺ 人 B 淋巴瘤，抗 CD19 CAR-T 最经典靶）；MC38-luciferase-hCD19（小鼠结肠癌稳转人 CD19 与萤光素酶，悬浮/贴壁实验通用，亦可体内成像）；② 效靶比梯度——常用 0.3:1、1:1、3:1、10:1 四个点，绘制杀伤-剂量曲线；③ 时间点——4-6 小时侧重直接裂解，16-24 小时观察持续杀伤。
读出方法对比：萤光素酶法（裂解释放或底物反应）线性范围宽、灵敏度高，是定量首选；LDH 释放法无需标记靶细胞，但需扣除效应细胞自发 LDH 背景；流式 CD45⁺/活死双染直接分别计数效应与靶细胞，可获得绝对杀伤率与效应细胞存活信息，三者可联用互证。
特异性验证不可或缺
杀伤实验必须设置抗原阴性对照证明杀伤是 CAR-抗原依赖的：Raji CD19 KO（CL006）与野生型 Raji 平行对比，抗 CD19 CAR-T 应只杀伤野生型；Jurkat（CD19⁻）等不表达靶抗原的细胞同样适用。对照体系是排除非特异性杀伤、判断 on-target 效应的关键，也是发表与申报材料中的必备数据。
- 效应细胞：CAR-T（SN3101 分选 + AH2001 激活 + CAR 病毒转导）
- 靶细胞：Raji（CL003）/ MC38-luciferase-hCD19（CL008，萤光素酶报告便于杀伤定量）
- 阴性对照：Raji CD19 KO（CL006）或 Jurkat（CD19⁻）验证抗原特异性
- 检测方法：共培养后荧光素酶活性（Bio-Glo）/ LDH 释放 / 流式活死染色，计算特异性裂解率
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常见问题
效靶比应该如何设置？
初次实验建议设 0.3:1、1:1、3:1、10:1 四个梯度绘制完整剂量-杀伤曲线；确认窗口后再围绕 EC50 附近加密设置。效靶比过低会低估杀伤、过高则掩盖 CAR 间差异。注意按 CAR⁺ 阳性率折算实际效应细胞数。
共培养多长时间检测合适？
4-6 小时检测主要反映穿孔素/颗粒酶介导的直接裂解；16-24 小时可观察连续杀伤（serial killing）与细胞因子积累，但需关注效应细胞自身的活化与耗竭状态。建议两个时间点同时设置，分别呈现快速杀伤与持续杀伤能力。
LDH 法与萤光素酶法结果不一致怎么办？
两法敏感性线性范围不同：LDH 检测死亡释放的胞内酶，晚期凋亡/坏死才释放，且需扣除效应细胞自发 LDH；萤光素酶在靶细胞死亡初期即可丢失活性。以萤光素酶定量的杀伤率通常出现更早，建议以同一方法做组间比较，跨方法直接比较需谨慎。