从 T 细胞分选、CD3/CD28 激活到 CAR 基因递送与扩增质检——本页梳理 CAR 分子的结构逻辑与 CAR-T 制备的完整时序，并给出靶点/载体选择与现货产品方案。
CAR 分子结构与代次演进
嵌合抗原受体（CAR）是人工设计的跨膜蛋白，由外而内依次为：单链抗体（scFv，识别域）—铰链区（提供柔性伸展空间）—跨膜区—共刺激域—CD3ζ 胞内区（含 ITAM，提供信号 1）。scFv 决定靶点特异性，共刺激域决定信号强度与持久性。
代次演进：第一代 CAR 仅含 CD3ζ，体外可杀伤但体内扩增与持久性不足；第二代在 CD3ζ 基础上加入一个共刺激域（CD28 或 4-1BB），是当前临床主流——CD28 信号快而强，倾向效应分化；4-1BB 信号温和持久，利于记忆样表型与疲劳抵抗，在 CD19 CAR-T 血液瘤中表现更持久。第三代叠加双共刺激域，在部分实体瘤探索中使用。
制备流程与时序
标准 CAR-T 制备时序：① 分选（无柱阴选获得功能完好的 T 细胞）；② 激活（ActBeads™ CD3/CD28 磁珠 24-48 小时，细胞进入分裂状态）；③ 转导（逆转录病毒感染分裂期细胞，此时效率最高；慢病毒可感染非分裂细胞，窗口更宽）；④ 扩增（IL-2/IL-21 支持，7-14 天）；⑤ 质检（GFP 或流式检测转导率、体外杀伤验证、无菌与内毒素检测）。
RNA 电转（如 EasyTune™ T 细胞 RNA 转染试剂 T6001）可实现 CAR 瞬时表达 3-7 天，无需病毒整合，适合 CAR 结构快速筛选与功能验证，安全性好、周期短，是质粒级验证与早期优化的利器。
靶点与载体选择
靶点选择兼顾肿瘤表达特异性与正常组织安全性：CD19 是 B 细胞恶性肿瘤的经典靶点（B 细胞发育全程表达、正常组织冗余度低）；EPCAM、HER2、GD2 等靶点在实体瘤探索中各有定位。英诺思现货逆转录病毒 CAR 载体覆盖 anti-hCD19、anti-hEPCAM、anti-hHER2、anti-hGD2 等多靶点，采用鼠源 4-1BB/CD3ζ 信号结构域并携带 GFP 报告基因，转导效率可直接以 GFP 读出。
- 分选：SN3101/SN4101 无柱阴选获得功能完好 T 细胞（CAR-T 首选）
- 激活：ActBeads™ CD3/CD28（AH2001/AM2001），可洗脱收集
- 递送：现货逆转录病毒 CAR 载体（anti-hCD19 等）、人 T 细胞专用 RNA 转染试剂（T6001）、慢病毒（LVm3/LVh45）
- 扩增与冻存：人 T 淋巴细胞培养基（C300100）+ IL-2/IL-21 + 无血清冻存液（CR101）
- CAR-T 制备（上门服务）可整体委托英诺思完成
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常见问题
逆转录病毒与慢病毒转导如何选择？
逆转录病毒滴度高、只感染分裂期细胞（正好匹配激活后 24-48h 的 T 细胞），且不会转入静息细胞，背景干净；慢病毒可感染非分裂细胞、转导窗口更宽，适合难激活或需转导静息亚群的场景。若只做 CAR 结构验证，RNA 电转瞬时表达更快捷安全。
实验室缺乏 CAR-T 制备经验与设备怎么办？
英诺思提供 CAR-T 制备上门服务：客户只需提供样本与靶点需求，技术团队携全套试剂（分选、激活、病毒、培养基）到现场完成制备与基础质检；也可只采购各环节产品按本页流程自行搭建。
转导效率多高才算成功？
以 GFP 报告或抗 CAR 抗体染色读出，体外研究用途通常 30% 以上即可开展杀伤实验（可按阳性率折算效靶比）；若需高纯度群体，转导后可经磁珠分选富集 CAR⁺ 细胞。同一实验内保持一致的转导条件比追求绝对效率更重要。