CAR-T 的功能由 CAR 分子的序列与结构决定，而 CAR 的效力最终要在杀伤实验与动物模型中读出。本页按「设计 — 筛选 — 验证」的顺序，梳理从 scFv 序列发掘、CAR-抗原亲和力检测、跨膜域与胞内域定制，到靶细胞制备、体外杀伤验证与动物模型验证的六个环节，并给出各环节的关键控制点与产品方案。
scFv 序列发掘与筛选
CAR 的靶点识别完全由胞外的单链抗体（single-chain variable fragment，scFv）决定，胞内信号模块不参与抗原识别。因此，理论上任何能被抗体识别的细胞表面分子——膜蛋白、糖蛋白或糖脂表位——都可以设计为 CAR 靶点，且识别过程不依赖 MHC 提呈。更换靶点只需替换 scFv 序列，由铰链区、跨膜域、共刺激域与 CD3ζ 组成的经典 CAR 骨架可以继续沿用。
scFv 由抗体重链可变区（VH）与轻链可变区（VL）经柔性 linker 连接而成，常见形式为 VH—(G4S)₃—VL；序列来源包括杂交瘤细胞、噬菌体展示文库、单个 B 细胞克隆以及已公开的抗体序列。序列发掘的核心，是把「抗体识别能力」转换为「受体编码序列」，需要依次考虑四个层面：
scFv 序列筛选的四个层面
- 序列可行性：可变区序列测定与 CDR 边界确认，密码子优化后克隆入 CAR 骨架，避免引入移码、异常糖基化位点或强二级结构
- 表位可及性：表位须位于靶分子的胞外域且在细胞膜表面可被结合，同时排除与同家族分子共享的交叉表位
- 特异性与安全性：核对靶抗原在正常组织的表达谱，评估 on-target / off-tumor 风险
- 亲和力窗口：亲和力过低会导致激活阈值不足、杀伤无力；过高则可能提高对低表达正常组织的识别概率
英诺思生物具备 scFv 序列发掘与 CAR 载体构建的技术平台和经验，可完成从抗体可变区序列获取、序列改造与优化，到克隆入经典 CAR 骨架并验证膜表达的完整环节，并与后续的亲和力检测与功能筛选在同一体系内衔接。
CAR-抗原亲和力检测
确认 scFv 能否结合目标抗原，是在投入病毒包装与稳定株构建之前必须完成的一步。检测体系的构建方式是：将待测 scFv 序列融合在经典 CAR 序列的 N 端（依次连接铰链区、跨膜域、共刺激域与 CD3ζ），转染进入细胞后 CAR 会表达在细胞膜上，此时的 CAR 相当于一个固定在膜表面的抗体分子。
检测则使用人 Fc 融合的重组抗原作为探针：抗原通过其天然构象与膜上 CAR 的 scFv 结合，再用荧光标记的 anti-Fc 二抗进行检测，流式读取荧光强度。这样设计有两方面考虑：其一，Fc 融合使抗原以二聚体形式呈递，更接近天然配体的空间构象；其二，Fc 段提供通用检测位点，一套 anti-human Fc 二抗即可覆盖所有不同 scFv 的 CAR，无需为每个 CAR 单独制备抗独特型抗体。
将抗原-Fc 按浓度梯度稀释，可以得到结合曲线并做相对亲和力排序。需要注意的是，结合信号必须用 CAR 的膜表达量归一——只有在各构建体膜表达水平相当的条件下，荧光强度差异才反映亲和力差异，否则无法区分「表达量高」与「结合能力强」。常规做法是平行用抗 CAR 骨架抗体染色，或借助共表达标签校正表达量。
检测体系的关键对照
- 空载体转染细胞：确定背景信号水平
- 无关 scFv 的 CAR：特异性对照，排除 Fc 段或骨架引起的非特异结合
- 已知亲和力的 CAR：作为横向比对标尺
- 膜表达量归一：抗 CAR 骨架抗体平行染色，或共表达标签校正
跨膜结构域与胞内结构域筛选
scFv 决定「识别什么」，其余结构域决定「识别之后如何应答」。各段的功能分工并不相同：信号肽负责把 CAR 定向转位到细胞膜；铰链区在 scFv 与膜之间提供柔性伸展空间，影响表位可及性与受体二聚化；跨膜域决定膜上稳定性以及与内源受体的相互作用；共刺激域与 CD3ζ 共同决定胞内信号的强度、动力学与持久性。
| 结构域 | 经典骨架 | 功能要点 |
|---|---|---|
| 信号肽 | CD8α signal | 引导 CAR 前体定向转位至细胞膜，决定膜表达的起始效率 |
| 铰链区 | CD8α hinge | 在 scFv 与细胞膜之间提供柔性伸展空间，影响表位可及性与激活阈值 |
| 跨膜域 | CD8α TM | 锚定于细胞膜并介导受体二聚化，是信号跨膜传递的结构基础 |
| 共刺激域 | CD28 | 提供信号 2，决定扩增倍数、存活、细胞因子分泌与效应分化走向 |
| 激活域 | CD3ζ（含 ITAM） | 提供信号 1，驱动细胞毒效应 |
按共刺激域的不同，CAR 可分为几个代次：第一代仅含 CD3ζ，体外可杀伤，但体内扩增与持久性不足；第二代在 CD3ζ 之外增加一个共刺激域，是当前研究与临床的主流结构——英诺思经典骨架即选用 CD28；第三代叠加双共刺激域，在部分实体瘤方向探索。共刺激元件的选择会改变信号动力学：CD28 启动快而强、倾向效应分化，4-1BB 温和持久、有利于记忆样表型，二者可在同一 scFv 与同一靶细胞条件下平行比较后择优。
英诺思生物的经典 CAR 骨架为 CD8 信号肽–scFv–CD8 铰链–CD8 跨膜–CD28–CD3ζ：现货逆转录病毒产品线（CAR-T 开发与现货 CAR-T 病毒）采用其中的小鼠 CAR 骨架（mCD28-mCD3ζ），携带 GFP 报告基因用于转导效率示踪，覆盖 hCD19、hEPCAM、hHER2、hGD2 与 mCD19 等靶点。骨架内的跨膜结构域与胞内结构域可按研究需求筛选、定制——构建结构域变体后，在同一 scFv 与同一靶细胞条件下平行比较膜表达量、信号磷酸化、细胞因子分泌、杀伤效力与体内持久性，据此确定与目标适应症适配的结构组合。
靶细胞制备
靶细胞是杀伤实验的「标尺」，其质量直接决定杀伤数据的可靠性。制备的核心要求是：抗原表达稳定均一、经流式确证定位于细胞膜表面，并携带可用于定量与示踪的报告基因。
靶细胞制备流程
- 抗原过表达：以慢病毒或逆转录病毒将目标抗原导入肿瘤细胞系（如 MC38、Raji、K562），也可通过定点敲入实现内源表达
- 流式确证上膜：用抗目标抗原的荧光抗体做表面染色（不破膜），确认抗原定位于细胞膜而非胞内聚集，同步记录阳性率与 MFI 作为后续杀伤读数的基线
- 单克隆化：有限稀释挑取单克隆，选择表达均一、传代稳定的克隆——抗原表达量漂移会直接干扰杀伤数据
- luciferase 标记：同步导入萤光素酶基因（双顺反子载体或共转导），建立抗原⁺ / luc⁺ 双阳性靶细胞，用于后续示踪 CAR-T 的杀伤效果
- 阴性对照靶细胞：保留亲本细胞或抗原阴性克隆，用于验证杀伤的抗原特异性
以本页 05 所示实验为例：在 MC38 细胞中过表达人的 CD19 分子，构建 MC38-hCD19 靶细胞以模拟 CD19⁺ 肿瘤细胞——先以流式确认 hCD19 在膜表面的表达，再用该靶细胞评价靶向 hCD19 的小鼠 CAR-T 的杀伤能力。
体外杀伤验证
将靶细胞和 CAR-T 细胞共培养，即可检测 CAR-T 对靶细胞的杀伤作用。常规设计为效靶比梯度（如 0.5:1、1:1、5:1）配合多时间点（4、8、24、48 h），并平行设置效应细胞单独培养、靶细胞单独培养以及抗原阴性靶细胞的对照。
读出方式上，形态学观察与萤光素酶定量互为补充。显微镜观察可直观看到靶细胞的形态变化——皱缩、变圆、脱壁与碎裂，无需标记即可在第一时间判断杀伤是否发生；萤光素酶定量则利用靶细胞携带的 luciferase：加入底物后读取相对发光值（RLU），活靶细胞数与发光强度成正比，可按「杀伤率 =（1 - 实验组 RLU / 靶细胞单独组 RLU）× 100%」换算，灵敏度高、可重复，适合效靶比与时间点的矩阵式比较。流式凋亡染色（Annexin V/PI）、LDH 释放与实时成像可作为补充读出。
本页所示实验：在 MC38 细胞中过表达人的 CD19 分子，模拟 CD19⁺ 的肿瘤细胞；构建靶向 human CD19 的小鼠 CAR 分子，并制备逆转录病毒感染小鼠 T 细胞，制备靶向 hCD19 的小鼠 CAR-T。将 CAR-T 细胞和 MC38-hCD19 细胞按照 1:1 比例共培养 24 小时，可以观察到靶细胞被迅速杀伤。
动物模型验证
体外杀伤阳性之后，动物模型用于回答两个问题：靶细胞在体内能否稳定成瘤，以及 CAR-T 能否在体内有效清除肿瘤。
第一步是验证靶细胞的成瘤情况。将 MC38-hCD19 皮下或经尾静脉接种小鼠，绘制瘤体积生长曲线，确认成瘤率与生长速度的均一性；若个体差异较大，可进一步筛取成瘤一致的亚克隆用于正式实验。
第二步是评价体内的杀伤效果。荷瘤小鼠随机分为 PBS、未转导 T 细胞与 CAR-T 组，尾静脉回输不同剂量的 CAR-T，定期测量瘤体积、体重与生存期。模型选择上，免疫缺陷小鼠（如 NSG）配合人源肿瘤与人 CAR-T 适合人源 CAR 的评价；同源小鼠模型（如 C57BL/6 配合 MC38-hCD19 与小鼠 CAR-T）免疫系统完整，更接近真实的肿瘤免疫环境。
体内的机制层面读出
- 瘤组织 CAR-T 浸润：流式或免疫组化分析
- 靶抗原表达变化：监测肿瘤细胞的抗原逃逸
- 外周血 CAR 拷贝数：qPCR 定量体内扩增与存续
- 血清细胞因子：IFN-γ、IL-2、TNF-α 等，同步关注细胞因子释放相关指标
- 活体成像：luc⁺ 靶细胞配合活体成像系统，动态观察肿瘤负荷变化
实验要点
- 分选：SN3101/SN4101 无柱阴选获得功能完好 T 细胞（CAR-T 首选）
- scFv：可变区序列发掘、序列改造与 CAR 载体构建可整体委托英诺思完成
- 亲和力：scFv 融合于经典 CAR 的 N 端表达在细胞膜上，以 Fc 融合抗原 + anti-Fc 二抗流式检测
- 激活：ActBeads™ CD3/CD28（AH2001/AM2001），24-48 h 进入分裂期后转导效率最高
- 递送：现货逆转录病毒 CAR 载体（骨架 CD8 signal–scFv–CD8 hinge/TM–CD28–CD3ζ，anti-hCD19 等）、慢病毒（LVm3/LVh45，亦用于靶细胞抗原过表达）
- 靶细胞：抗原过表达后必须表面染色确认上膜，并单克隆化以保证表达均一
- 杀伤读出：显微镜定性观察 + luciferase 定量互补，配合抗原阴性靶细胞做特异性对照
- 扩增与冻存：人 T 淋巴细胞培养基（C300100）+ IL-2/IL-21 + 无血清冻存液（CR101）
推荐产品（按种属分类）
细胞分选（阴选）
SN3101人CD3 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）总T细胞SN3102人CD4 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）CD4⁺辅助TSN3103人CD8 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）CD8⁺细胞毒TSN3104人naive CD4 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）极化实验推荐SN3107人naive CD8 T细胞分选试剂盒（无柱阴选）细胞分选（阳选）
PH003anti-human CD3 Nanobeads（有柱阳选）PH004anti-human CD4 Nanobeads（有柱阳选）PH008anti-human CD8 Nanobeads（有柱阳选）细胞分选Buffer
EISO0500EasyIsoBuffer™ 细胞分选缓冲液人/小鼠通用常见问题
CAR 是否只能针对某个固定靶点设计？
不是。CAR 的靶点识别完全由胞外 scFv 决定，理论上任何能被抗体识别的细胞表面分子（膜蛋白、糖蛋白或糖脂表位）都可设计为 CAR 靶点，且识别不依赖 MHC 提呈。换靶点只需替换 scFv 序列，其余骨架（铰链、跨膜、共刺激与 CD3ζ）可沿用同一套经典 CAR 结构。
scFv 的亲和力是不是越高越好？
不是。亲和力过低会导致 CAR 激活阈值不足、杀伤无力；过高则可能提高对低表达正常组织的识别概率，并加剧 T 细胞持续激活与耗竭。实践中存在功能窗口，先按亲和力梯度筛出候选 scFv，再用同一套靶细胞与杀伤体系平行比较，以功能数据确定最优克隆。
CAR-抗原亲和力检测为什么用 Fc 融合抗原加 anti-Fc 二抗？
人 Fc 融合使抗原以二聚体形式呈递，更接近天然配体的空间构象；同时 Fc 段提供一个通用检测位点——一套荧光标记 anti-human Fc 二抗即可检测所有不同 scFv 的 CAR，无需为每个 CAR 单独制备抗独特型抗体。将 scFv 融合在经典 CAR 骨架 N 端瞬时转染细胞后，CAR 表达于细胞膜，流式读取荧光强度即可完成结合能力排序。
靶细胞为什么建议同时导入 luciferase？
luciferase 为靶细胞提供一个可定量的存活标记：体外杀伤中加入荧光素底物读取发光值，活靶细胞数与信号强度成正比，可计算杀伤率并与效靶比、时间点构成矩阵；体内实验中同一批靶细胞可通过活体成像动态观察肿瘤负荷。抗原上膜情况则必须另用表面染色流式确认，两者互为补充。
逆转录病毒与慢病毒转导如何选择？
逆转录病毒滴度高、只感染分裂期细胞（正好匹配激活后 24-48h 的 T 细胞），且不会转入静息细胞，背景干净；慢病毒可感染非分裂细胞、转导窗口更宽，适合难激活或需转导静息亚群的场景，也是构建抗原过表达靶细胞的常用载体。若只做 CAR 结构验证，RNA 电转瞬时表达更快捷安全。
实验室缺乏 CAR-T 制备经验与设备怎么办？
英诺思提供 CAR-T 制备上门服务：客户只需提供样本与靶点需求，技术团队携全套试剂（分选、激活、病毒、培养基）到现场完成制备与基础质检；也可只采购各环节产品按本页流程自行搭建。
转导效率多高才算成功？
以 GFP 报告或抗 CAR 抗体染色读出，体外研究用途通常 30% 以上即可开展杀伤实验（可按阳性率折算效靶比）；若需高纯度群体，转导后可经磁珠分选富集 CAR⁺ 细胞。同一实验内保持一致的转导条件比追求绝对效率更重要。