CAR-T疗法的常用NSG鼠或裸鼠肿瘤模型进行抗肿瘤活性评价，包括细胞系来源的异体移植肿瘤（CDX）模型和人源性组织异种移植（PDX）模型。但由于NSG鼠和裸鼠存在免疫缺陷，如果想要评价小鼠不同基因型（如代谢调控）对CAR-T的影响或其他免疫细胞对CAR-T的影响，则需要在小鼠肿瘤模型中进行CAR-T抗肿瘤效果评价。

英诺思生物提供细胞分选试剂盒+培养套装+CAR-T逆转录病毒包装服务+靶细胞构建等。

一、嵌合抗原受体（CAR）结构

CAR目前已发展至四代，由于第三代和第四代CAR在小鼠T细胞中极易丢失，目前小鼠CAR常以第二代为主。第二代嵌合抗原受体（CAR）的结构主要为CD8 Signal、抗体scfv、CD8 hinge、CD8TM、CD28、CD3ζ。

图1：CD19 CAR结构示意图
图1：CD19 CAR结构示意图

载体选择：MSCV（鼠干细胞病毒）逆转录病毒载体和MMLV（莫洛尼鼠白血病病毒）逆转录病毒载体。由于小鼠T细胞几乎不表达LDLR受体，慢病毒感染小鼠T细胞效率非常低。将CAR由逆转录病毒载体进行携带并感染小鼠T细胞，即可获得小鼠CAR-T细胞。

二、逆转录病毒包装及纯化

（一）病毒包装体系选择

  1. 体系1：细胞：293T/Phoenix ECO，质粒：PCL-ECO和PMSCV或MMLV，转染试剂：PEI
  2. 体系2：细胞：Plat-E，质粒：PMSCV或MMLV，转染试剂：PEI

（二）病毒包装（以体系2为例）

  1. 细胞复苏：取冻存的Plat-E细胞在37℃进行快速溶解，离心后将细胞沉淀由DMEM完全培养基重悬，并培养至T25细胞培养瓶中，传代2次后即可使用。
  2. 细胞铺板：取生长良好的Plat-E细胞，由胰酶消化后进行铺板（10cm皿为例）。取1×106个细胞加入至10cm细胞培养皿中，由8字混匀法进行混匀，混匀后放入细胞培养箱培养24-48小时。
  3. 质粒转染（PMSCV-eGFP-mCD19）：
    1. 待Plat-E细胞密度至70%-80%，弃掉上清，加入新鲜无抗生素DMEM完全培养基。
    2. 取1mL DMEM基础培养基（或者OPTI-MEM基础培养基）加入10μg PMSCV-eGFP质粒和30 μL PEI转染试剂，用移液枪吹打均匀后室温放置10-15min。
    3. 将混匀后的培养基，均匀滴加至10 cm细胞培养皿中。
    4. 6-8小时后，更换新鲜DMEM完全培养基。
    5. 48小时后，荧光显微镜下观察转染效率。
  4. 病毒收取：分别收取48小时和72小时的病毒上清（约20mL），并放置于4℃冰箱。
图2：病毒包装过程中转染实例（PEI法）
图2：病毒包装过程中转染实例（PEI法）

（三）CAR-T病毒纯化

方法选择（以超速离心法为例）：超速离心法、超滤管浓缩法、浓缩试剂盒浓缩法。

  1. 将48小时和72小时的病毒上清于4℃ 2000g离心5min，去除细胞沉淀。
  2. 收集上清，并由0.45 μm细胞滤器进行过滤，去除细胞碎片。
  3. 将48小时和72小时的病毒混匀，混匀后加入至超速离心管（无菌）中，配平至误差小于0.01g，并进行超速离心，26000 rpm（约80000g），4℃，离心2.5h。
  4. 离心结束后，可观察到病毒白色沉淀贴附于底部管壁，由吸管缓慢吸弃上清（注意：不可吸到沉淀），加入0.5mL预冷的PBS溶液进行重悬，放置于4℃ 30min。
图3：逆转录病毒超速离心后的病毒沉淀
图3：逆转录病毒超速离心后的病毒沉淀
  1. 待病毒完全溶解后，将病毒由0.22 μm细胞滤器进行过滤，除菌（可选）。
  2. 将溶解后的病毒以50-100 μL每管进行分装，冻存于-80°冰箱保存。

三、小鼠T细胞分选及激活培养

（一）小鼠T细胞分选

小鼠脾脏淋巴细胞获取：

  1. 将小鼠断颈处死后，在无菌环境下取出小鼠脾脏，放置于70 μm细胞筛网中研磨，用英诺思生物FACS buffer缓冲液（#EISO0500）进行冲洗，获得单细胞悬液。
  2. 按照细胞分选试剂盒进行细胞分选所需的T细胞类型，CD3 T细胞（#SN4101），CD4 T细胞（#SN4102）或者CD8 T细胞（#SN4103）。
Note: 1-2步骤中需要的缓冲液要求比较高，劣质的缓冲液会导致后续T细胞无法很好地激活，最终也无法被很好地病毒感染。

（二）小鼠T细胞激活及培养

  1. 推荐采用英诺思生物T淋巴细胞专用培养基（#C400100），也可以自行配置，配方如下：1640基础培养基 + 10%FBS + 1%P/S + 1%L-Glutamine + 50μM β巯基乙醇 + 1% 非必须氨基酸 + 1% HEPES。
  2. 将分选出的小鼠T细胞（2×106/mL）与T细胞CD3/CD28激活磁珠（#AM2001）按1:1混匀，加入至24孔细胞培养板（1mL/孔），注意：24孔细胞培养板需为未TC处理（non-treated）。
  3. 24-48小时后可观察到T淋巴细胞显著聚团，并且出现膨大，表面T细胞已激活。
  4. 若继续培养，可按隔天1:3进行传代处理。
图4：T细胞激活形态变化
图4：T细胞激活形态变化

四、小鼠T细胞病毒转染/CAR-T细胞构建

  1. Day0：在24孔non-treated细胞培养板中加入1mL 20 μg/mL Retronectin，用封口膜封闭孔板的盖和底座后，4℃过夜。
  2. Day1：吸弃Retronectin上清，加入2% BSA室温封闭2h，再用PBS润洗一遍。
  3. Day1：将纯化的PMSCV-eGFP-mCD19逆转录病毒用PBS进行稀释，按5、10、20、50 MOI加入至24孔non-treated细胞培养板中，2000g-4000g 4℃水平转离心2-3h。
  4. Day1：吸弃上清，病毒此刻被包被在孔板上。每孔加入8×105 T细胞，封口膜封闭，300g平转离心5min后，放入细胞培养箱。
  5. Day3：48小时后可观察到绿色荧光表达，并将细胞按1:3进行传代。
  6. Day4：72小时，可流式细胞术测定阳性率。
    1. 若病毒含有eGFP或mcherry等荧光标记，可直接用流式细胞仪测定阳性率。
    2. 若病毒不含eGFP或mcherry等荧光标记，可用Protein L-FITC或者anti-4GS linker-FITC等流式抗体对CAR-T细胞标记30min，再用流式细胞仪测定阳性率。
图5：CAR-T细胞绿色荧光表达
图5：CAR-T细胞绿色荧光表达
图6：CAR-T流式检测
图6：CAR-T流式检测

五、肿瘤细胞稳转株构建（以MC38-mCD19-luc为例）

（一）慢病毒Lentivirus-mCD19-puro/Lentivirus-luciferase-G418病毒构建

  1. 取生长良好的293T细胞进行铺板。（以10cm细胞培养皿为例）
  2. 待293T细胞生长至密度70%-80%，进行转染。
  3. 将质粒Plvx-mCD19-puro/Plvx-luciferase-G418：PSPAX2：PMD2.G按4：3:1与48 μL PEI进行混匀（共16 μg），室温放置10-15min。
  4. 将转染混合液均匀滴加至10cm细胞培养皿中，6-8小时换液，并收取48和72小时的病毒上清。
  5. 按超速离心法对Lentivirus-mCD19-puro/Lentivirus-luciferase-G418慢病毒进行纯化，同逆转录病毒纯化。

（二）MC38-mCD19稳转株构建

  1. 取生长良好的MC38细胞，胰酶消化后，按1×105个细胞加入至6孔细胞培养板中。
  2. 待密度生长至30%-50%，按10 MOI将Lentivirus-mCD19-puro病毒+10ng/mL polybrene + 2mL DMEM培养基进行混匀，吸弃上清，加入混合液，并放置于细胞培养箱进行培养，24小时后进行换液。
  3. 72小时后，弃掉上清，加入含5 μg/mL puromycin DMEM细胞培养基。
  4. 用含5 μg/mL puromycin DMEM细胞培养基基础培养7-14天，即可获得MC38-mCD19稳转株。
  5. 通过流式检测MC38细胞株CD19的表达情况。如有需要，可以挑取单克隆细胞株。

（三）MC38-mCD19-luciferase稳转株构建

  1. 取生长良好的MC38-mCD19细胞，胰酶消化后，按1×105个细胞加入至6孔细胞培养板中。
  2. 待密度生长至30%-50%，按10 MOI将Lentivirus-luciferase-G418病毒+10ng/mL polybrene + 2mL DMEM培养基进行混匀，吸弃上清，加入混合液，并放置于细胞培养箱进行培养，24小时后进行换液。
  3. 72小时后，弃掉上清，加入含800 μg/mL G418 DMEM细胞培养基。
  4. 用含800 μg/mL G418 DMEM细胞培养基基础培养14天，即可获得MC38-mCD19-luciferase稳转株。
  5. 若需要MC38-mCD19-luciferase单细胞稳转株，可将MC38-mCD19-luc细胞在96孔细胞培养板中进行梯度稀释，稀释至最后一列每孔只含1个单细胞。
  6. 将最后一列单细胞进行扩大培养，并由WB和流式鉴定。

六、CAR-T杀伤活性测试

  1. 取生长良好的MC38-mCD19-luciferase细胞于24孔细胞培养板进行铺板，每孔1×105个细胞。
  2. 待细胞贴壁后，吸弃上清，按效靶比1：1、2：1、4：1、8：1，将小鼠CAR-T-mCD19细胞按每孔1×105、2×105、4×105、8×105个细胞加入，与MC38-mCD19-luc细胞共孵育48小时。
  3. 48小时后，吸取上清，采用荧光素酶底物测定培养基中的luciferase的值。
Note: MC38细胞被杀伤后，luciferase会被释放到培养基中，上清中luciferase活性越高，代表T细胞杀伤越强。
  1. 细胞用PBS润洗2次，加入500μL 1mg/mL荧光素酶底物（buffer自带裂解细胞效果，若buffer不可裂解细胞，则需要用ATP裂解液对细胞裂解20min后加入荧光素酶底物），上机读取数据。
Note: 测定细胞中剩余的luciferase活性，数值越低，则说明剩余的MC38细胞越少，代表T细胞杀伤越强。
  1. 也可以直接收集细胞进行流式分选，观察肿瘤细胞和T细胞之间的比例变化（这一方法往往不是很精准，因为肿瘤细胞和T细胞都会增殖）。
图7：CAR-T体外杀伤能力测试
图7：CAR-T体外杀伤能力测试

英诺思生物提供完善的小鼠CAR-T制备方案，包括细胞分选+T细胞激活磁珠+细胞因子+CAR-T设计和病毒+肿瘤细胞株等。

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