技术干货 | 小鼠脾脏T细胞CFSE增殖实验详细操作指南

制备脾脏单细胞悬液

1. 断颈或使用二氧化碳处死小鼠，使用75%酒精消毒后取出脾脏，PBS洗2遍，放置于70 μm无菌细胞滤网上。
2. 将脾脏所在的细胞滤网放入50 mL离心管，加入2 mL PBS，用注射器活塞轻轻研磨脾脏，使用EasyIso缓冲液反复冲洗细胞至离心管中。
3. 以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
4. （可选）红细胞裂解：加入2 mL 1× ACK缓冲液，室温孵育1分钟。
5. （可选）加入5倍体积的PBS中和裂解液，400 × g离心5分钟，弃去上清液。

6. 进行细胞计数。

增殖荧光染料标记细胞

7. 用PBS重悬细胞，调整细胞浓度为2×10⁷/mL。
8. 使用1× PBS将增殖荧光染料（如CFSE，eFluo450等）稀释至10 μM（2×浓度）。

9. 将等体积10 μM CFSE加入细胞悬液中，终浓度为5 μM，迅速混匀并在37°C细胞培养箱中避光孵育10分钟。
10. 加入5倍体积的完全培养基（包含10% FBS），轻轻漩涡混匀，在4°C孵育5分钟终止反应，400 × g离心5分钟，弃去上清液。
11. 使用EasyIso™细胞分选缓冲液洗涤2次，重复步骤10。

细胞分选与激活

12. 按照细胞分选试剂盒说明书对细胞进行分选。

13. 用T细胞培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1 × 10⁶/mL，每孔100 μL，最终每孔细胞数为1 × 10⁵/孔。
14. 每孔补充100 μL T细胞激活培养基（T细胞激活培养基包含终浓度为100 U/mL human IL2，和25 μL/mL ActBeads T细胞激活磁珠）。
15. T细胞激活后24小时，镜下观察可以发现T细胞变大或者变长，代表T细胞得到很好的激活。可以采用CD25、CD69、CD71等标志物检测T细胞活化的情况。
16. T细胞激活后48-72小时，可以取部分细胞（如轻轻吹匀细胞，吸取50 μL），采用流式抗体和死活染料对细胞进行染色，最后进行流式分析，观察T细胞增殖峰的变化。

相关产品推荐

产品名称	货号
ActBeads™ Mouse T细胞激活磁珠	AM2001
EasyIso™ Mouse CD3 T cell Isolation Kit	SN4101
EasyIso™ Mouse CD4 T cell Isolation Kit	SN4102
EasyIso™ Mouse CD8 T cell Isolation Kit	SN4103
小鼠T淋巴细胞培养基	C400100
细胞分选缓冲液（EasyIso Buffer）	EISO0500
Human IL-2	CTK301