2026 年 6 月，Journal for ImmunoTherapy of Cancer 发表了南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）肝胆中心李相成、李长贤、张耀东团队的重要研究《USP1-mediated lipophagy-lipogenesis axis drives cholangiocarcinoma progression and immune evasion》。该研究通过多组学整合分析发现：去泛素化酶 USP1 在胆管癌（CCA）中高表达且提示不良预后，它通过 K48 连接的去泛素化同时稳定 ACLY（脂合成）与 ATG3（脂噬），双管齐下驱动长链不饱和脂肪酸（LCUFAs）的异常累积；肿瘤分泌的 LCUFAs 经 FABP5 被肿瘤相关巨噬细胞（TAMs)摄取，驱动 M2 极化并抑制 CD8⁺ T 细胞；而 TAMs 分泌的 CCL3 又通过 CCR5/β-catenin 轴上调肿瘤 USP1——形成自我强化的"代谢-免疫"恶性循环。在人源化 NOG 小鼠中，USP1 抑制剂 + 抗 PD-L1 + 巨噬细胞清除三联方案显著抑制肿瘤且无明显毒性。值得注意的是，本研究中人 CD8⁺ T 细胞的功能验证实验使用了英诺思生物（Eynos LifeScience）EasyIso 人 CD8 T 细胞分选试剂盒（货号 SN3103）——国产磁珠分选工具已进入肿瘤免疫学研究的核心实验环节。
一、研究背景：胆管癌的"冷肿瘤"困境与代谢之谜
胆管癌（CCA）起源于胆道上皮细胞，侵袭性强、治疗手段有限、预后极差。其肿瘤微环境（TME）呈典型的"冷肿瘤"表型：CD8⁺ T 细胞浸润匮乏、M2 型 TAM 浸润显著、Treg 高度活化——免疫检查点抑制剂（ICI）疗效不佳。
近年研究揭示，TME 中的代谢串流（metabolic crosstalk）是免疫抑制的重要推手：肿瘤细胞产生的脂质代谢物可作为细胞间通讯的"货币"。 Su 等曾报道 TAMs 通过上调 CD36 摄取游离脂肪酸促进自身 M2 极化。但一系列关键问题悬而未决：CCA 中异常累积的到底是哪类脂质？由哪个上游分子调控？肿瘤-巨噬细胞之间如何形成正反馈？能否作为治疗靶点？
二、多组学定位：油酸——胆管癌中累积最显著的长链不饱和脂肪酸
研究起点是对 30 对 CCA 与配对癌旁组织的非靶向代谢组学：161 个差异代谢物中 90 上调、71 下调，差异最显著的前列代谢物几乎全是脂质；通路富集指向不饱和脂肪酸生物合成、甘油磷脂代谢等。其中长链不饱和脂肪酸（LCUFAs）里，油酸（OA，C18:1）在肿瘤组织中丰度累积最为突出。
临床相关性数据令人印象深刻——OA 含量与：
- 淋巴结转移（p=0.004，r=0.514）；
- 肝脏侵犯（p=0.037，r=0.382）；
- 肿瘤大小（p=0.014，r=0.443）
均显著相关。且 OA 呈"先降后升"的动态变化：早期分化好的腺癌中反而低于正常组织，中晚期显著升高——提示肿瘤进展中存在阶段性代谢重编程。
对 11 对 LCUFA 高丰度组织做转录组测序，联合 TCGA、GSE32879 数据库与 GeneCards 脂代谢基因集交叉筛选，锁定两个候选基因：USP1 与 EPHB2。GSEA 分析显示只有 USP1 与多条脂代谢通路显著富集——去泛素化酶 USP1 就此成为主角。
临床验证：111 例 CCA 组织芯片（TMA）免疫组化证实 USP1 在肿瘤组织显著高表达；Kaplan-Meier 分析显示高 USP1 表达患者预后显著更差；多因素 Cox 回归确认 USP1 表达是术后总生存（OS）的独立预测因子。
三、核心机制一：USP1 同时踩住脂合成与脂噬"两个油门"
USP1 敲低后脂代谢组学显示 104 个差异脂质中 92 个下调，其中以 OA 为代表的 LCUFAs 变化最显著——而甘油三酯（TG）含量不受影响。功能实验层层递进：
- USP1 敲低→游离脂肪酸（FFA）减少、脂肪酸摄取不变、TG 不变，但脂肪酸氧化（FAO）、耗氧率（OCR）和 ATP 生成显著下降；
- 巧妙的抑制剂实验：ACC 抑制剂 firsocostat（FrC）阻断脂合成后，USP1 敲低反而使脂滴（LD）累积增加——说明 USP1 维持着"脂滴存储-释放"的动态平衡；
- ATGL（脂解关键酶）水平不受 USP1 调控，ATGL 抑制剂也不能取消 USP1 的效应——脂解途径排除；
- 而抑制自噬核心蛋白 ATG7 后，USP1 对 TG 的调控能力完全消失；电镜显示 USP1 促进自溶酶体（而非脂滴数量）形成；mRFP-GFP-LC3 双荧光报告系统、LC3-II/SQSTM1 免疫印迹、LC3 与脂滴共定位、PLIN2 与 LAMP1 共定位等一系列实验证实——USP1 促进的是脂噬（lipophagy）。
分子对接实验揭开了谜底。免疫沉淀质谱（IP-MS）筛选出与 USP1 相互作用的两个蛋白：ACLY（ATP-柠檬酸裂解酶，为脂肪酸合成提供乙酰辅酶 A 前体）和 ATG3（自噬体形成的关键 E2 样酶）。GST pull-down、截断体突变实验锁定了精确结合区域（USP1 的 201–400 位氨基酸、ACLY 的 N 端 1–620 位、ATG3 的 N 端 1–120 位）。
去泛素化机制解析堪称教科书级完整：
| 实验 | 结论 |
|---|---|
| WT-USP1 过表达剂量依赖性上调 ACLY/ATG3，催化失活突变体 C90A 无效 | 依赖酶活性 |
| 蛋白酶体抑制剂 MG132 可逆转 USP1 敲低引起的 ACLY/ATG3 下降 | 走泛素-蛋白酶体通路 |
| 放线菌酮（CHX）追逐实验：USP1 敲低缩短、过表达延长两蛋白半衰期 | USP1 稳定底物蛋白 |
| 泛素实验：USP1 特异性剪切 K48 连接的多聚泛素链，对 K63 无影响 | 经典"救蛋白"型 DUB |
| ATG3 的 K9 位点是 USP1 去泛素化的关键位点 | 精确定位 |
拯救实验（rescue）完成最后闭环：在 USP1 敲低的 CCA 细胞中单独回补 ACLY（恢复脂合成）或 ATG3（恢复脂噬）只能部分逆转表型，两者同时回补则完全恢复——皮下移植瘤、尾静脉肺转移、原位肝移植瘤三种模型均一致。USP1 是脂代谢的"总开关"：一手通过 ACLY 促进脂肪酸从头合成，一手通过 ATG3 促进脂噬释放，共同维持 LCUFAs 的异常累积。
四、核心机制二：FABP5⁺ 脂载巨噬细胞——免疫抑制的"中转站"
肿瘤细胞累积的 LCUFAs 并非自产自销，而是分泌进入 TME。单细胞数据分析（GSE138709、GSE171899）显示，TAMs 是 TME 中脂质摄取与代谢最活跃的免疫细胞群体。
体外 3D 共培养模型（单核细胞分化巨噬细胞 + CCA 细胞）结合转录组测序发现：共培养后巨噬细胞中 FABP5 和 CD36 显著上调，且肿瘤分化程度越低、FABP5 表达越高（CD36 无显著变化——与既往研究的关键差异点！）。单细胞亚群分析将 TAMs 分为 FCN1⁺、FABP5⁺、CCL5⁺、CD1C⁺ 四个亚群，其中 FABP5⁺ 巨噬细胞亚群随肿瘤进展比例进行性升高，是特征性的"脂载免疫抑制"亚群。
功能验证环环相扣：
- FITC 标记油酸（FITC-OA）示踪：肿瘤来源的 LCUFAs 确实被 TAMs 主动摄取，FABP5 敲低可阻断；
- FABP5 敲低逆转共培养引起的脂滴累积、脂肪酸摄取、ROS 升高、OCR 与 ATP 增强；
- CCA 来源脂肪酸经 FABP5 摄取后驱动 M2 极化（CD206/CD80 流式、CD68/CD206 双色免疫荧光），FAO 抑制剂 etomoxir 或抗氧化剂 NAC 均可抑制 M2 极化——脂代谢驱动，而非单纯的表型漂移；
- PPARγ 抑制剂 T0070907 下调 FABP5，而 FABP5 敲低又抑制 PPARγ 转录活性（荧光素酶报告基因）——FABP5/PPARγ 正反馈回路；
- 111 例 TMA：M2 TAMs（CD206⁺）浸润与不良预后显著相关，USP1 与 CD206 共高表达患者预后最差。
AAV 介导肝细胞特异性 USP1 敲除 + 水动力注射自发 CCA 模型证实：USP1 敲除显著降低肿瘤负荷、延长生存；肿瘤组织单细胞测序显示 USP1 缺失特异性抑制 TAMs 中 FABP5 表达（不影响 CD36/FABP4），显著减少 FABP5⁺ 亚群比例。
五、核心机制三：TAM-肿瘤正反馈——CCL3/CCR5/β-catenin 轴
故事还有惊人的反转：TAMs 会上调肿瘤细胞的 USP1。共培养后 CCA 细胞 USP1 mRNA 显著上调；Olink 蛋白组学发现共培养肿瘤细胞中 CCL3 和 MMP1 显著升高，但只有重组 CCL3（而非 MMP1）能特异性诱导 USP1 表达；ELISA 梯度实验证明 CCL3 主要来源于 TAMs；CCR5 拮抗剂 Maraviroc（而非 CCR1 拮抗剂 BX471）可阻断该效应；机制上 CCL3-CCR5 → β-catenin 核转位 → 结合 USP1 启动子（ChIP-qPCR 证实）→ USP1 转录上调。
至此，完整循环浮出水面：肿瘤 USP1 → ACLY/ATG3 双通路 → LCUFAs 累积分泌 → TAMs 经 FABP5 摄取 → M2 极化 + 抑制 CD8⁺ T 细胞 → TAMs 分泌 CCL3 → CCR5/β-catenin → 肿瘤 USP1 进一步升高——一个自我强化的"代谢-免疫"恶性循环，正是胆管癌免疫治疗耐药的代谢根源。
六、治疗突破：三联方案攻破免疫耐药
在最受关注的人源化 NOG 小鼠实验中（PBMC 重建人免疫系统，流式确认人 CD45⁺ 细胞成功植入），皮下移植瘤模型评估了联合方案：USP1 抑制剂（10 mg/kg）+ 抗 PD-L1 抗体（5 mg/kg）+ 巨噬细胞清除剂氯膦酸盐脂质体。
结果显示：抗 PD-L1 + 巨噬细胞清除即显著抑瘤，加入 USP1 抑制剂后疗效进一步增强（肿瘤体积与重量进一步下降）；各组小鼠体重无显著变化，安全性良好；流式与多重免疫组化显示三联治疗减少 TAMs 浸润、逆转 M2 极化、抑制 TAM 脂质摄取、促进 CD8⁺ T 细胞募集——"代谢干预 + 免疫治疗"的协同逻辑得到活体验证。
七、方法学注脚：EasyIso 磁珠分选支撑 CD8⁺ T 细胞功能实验
本研究"USP1-TAMs-CD8⁺ T 细胞"轴的功能验证依赖一个关键的体外共培养实验：从健康供者 PBMC 中分选 CD8⁺ T 细胞，CFSE 标记后经 CD3/CD28 磁珠 + IL-2 激活培养 3 天，再与 TAMs 条件培养基共培养，用 CFSE 稀释检测增殖、ELISA 检测 IFN-γ。论文 Methods 明确记载：
（CD8⁺ T 细胞使用 EasyIso 人 CD8 T 细胞分选试剂盒购自英诺思生物，货号 SN3103。）
"代谢重编程抑制 CD8⁺ T 细胞"是本研究的核心结论之一，而这个结论直接建立在分选所得 CD8⁺ T 细胞的纯度与活性之上——分选过程中若激活或损伤 T 细胞，CFSE 增殖曲线和 IFN-γ 读值都会失真。EasyIso 系列磁珠分选（阴性分选策略）在保证高回收率的同时最大限度保持 T 细胞的天然状态，为这类"条件培养基功能筛选"实验提供了可靠起点。国产细胞分选试剂盒正在成为肿瘤免疫学研究发表链条中的标准工具。
八、启示与展望
- 去泛素化酶的"一石二鸟"：USP1 不调控单一的代谢通路，而是同时稳定脂合成（ACLY）与脂噬（ATG3）两个方向的限速蛋白——这种"系统级"调控模式提示，针对 DUB 的治疗可能比针对单一代谢酶更彻底；
- FABP5 vs CD36 的分野：本研究发现 USP1-LCUFAs 轴特异性上调 FABP5 而不影响 CD36，提示不同肿瘤的脂肪酸摄取"门户"存在差异，FABP5⁺ 脂载巨噬细胞有望成为 CCA 的免疫代谢分型标志物；
- 早期 LC 脂酸"先降后升"的动态提示靶向脂代谢的时机选择可能影响疗效，需要时空组学进一步解析；
- 三联方案的转化路径：USP1 抑制剂已有临床前分子（如 KSQ-4279 等开发中），加上成熟的抗 PD-L1 与巨噬细胞清除策略，具备组合开发的现实基础。
九、结语
李相成团队这项研究把胆管癌的代谢重编程与免疫逃逸串成了一条完整的因果链：USP1 这只"看不见的手"，一手抓脂合成、一手抓脂噬，把油酸源源不断输送给巨噬细胞，把"冷肿瘤"越冻越结实；而反过来，巨噬细胞又用 CCL3 给肿瘤细胞的 USC1 添柴加火。打破循环的钥匙——USP1 抑制剂联合免疫治疗——已经在人源化小鼠身上初露锋芒。
当"管住代谢"与"解开免疫"并肩作战，胆管癌这个"冷肿瘤"的坚冰，或许终有消融的一天。
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Chen Y, Xu X, Shao S, et al. USP1-mediated lipophagy-lipogenesis axis drives cholangiocarcinoma progression and immune evasion. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2026;14:e015116. doi:10.1136/jitc-2026-015116
通讯作者：李相成、李长贤、张耀东（南京医科大学第一附属医院肝胆中心）